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Pesquisa de Salmonella sp. em alimentos
 

Metodologia Analítica Empregada

            A metodologia descrita a seguir é a preconizada pela Food and Drug Administration (FDA – USA), publicada no Bacteriological Analytical Manual, 8ª ed.[1]
 

            Esta metodologia é internacionalmente reconhecida e é uma alternativa à metodologia preconizada pela Instrução Normativa 62 do MAPA.

 

Índice:

1. Material necessário para análise

    1.1. Meios de cultura

    1.2. Equipamentos e outros materiais

2. Procedimento

    2.1. Preparo das amostras

    2.2. Fase de Pré-Enriquecimento das amostras

    2.3. Fase de Enriquecimento seletivo das amostras

    2.4) Fase de plaqueamento em meios seletivos

    2.5) Confirmação preliminar das colônias de Salmonella

    2.6) Testes sorológicos e bioquímicos para confirmação definitiva

 

 

1) Material necessário para análise

    1.1 Meios de cultura

            Pré-enriquecimento

                        - frascos contendo 225 mL de caldo lactosado

 

          Enriquecimento seletivo

                   - tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis (RV)

                   - tubos contendo 10 mL de caldo Tetrationato (TT)

 

          Plaqueamento diferencial

                   - placas de ágar Bismuto Sulfito (BS)

                   - placas de ágar Entérico de Hecktoen (HE)

                   - placas de ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)

 

          Confirmação (testes preliminares)

                   - tubos de ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)

                   - tubos de ágar Lisina Ferro (LIA)

            

          Confirmação (testes adicionais)

                   - tubos de caldo Uréia de Christensen

                   - tubos de caldo Vermelho de Fenol (0,5% Dulcitol)

                   - tubos de caldo Vermelho de Fenol (1,0% Lactose)

                   - tubos de caldo Vermelho de Fenol (1,0% Sacarose)

                   - tubos de caldo Triptona 1%

                   - tubos de caldo Malonato Modificado

                   - tubos de caldo VM-VP

                   - tubos de agar Citrato de Simmons

                   - tubos de caldo Descarboxilase de Moeller 1% Lisina

                   - reagente de Kovacs para teste de indol

                   - solução de Vermelho de Metila para teste de VM

                  

- reagente de Barrit para teste de VP (solução de α – naftol 5%,

solução de KOH 40%, creatina em cristais)

                   - anti-soro somático polivalente (Poli O)

                   - anti-soro flagelar polivalente (Poli H)

 

 

    1.2) Equipamentos e outros materiais

                   - sacos plásticos estéreis

                   - capela de fluxo laminar

                   - balança eletrônica

                   - homogeneizador de amostras (stomacher)

                   - aparelho medidor de pH

                   - estufa a 35ºC

                   - agitador de tubos

                   - banho-maria a 42ºC

                   - banho-maria a 43ºC

2) Procedimento          

 

    2.1) Preparo das amostras

          Em um saco plástico estéril serão pesados assepticamente 25g de pele e de músculos das regiões do pescoço, peito, cloaca e asas das carcaças. A seguir serão adicionados 225 mL de caldo lactosado (M1), procedendo-se então à homogeneização da amostra por um período de 2 min.. A seguir, a mistura deverá ser mantida em repouso, sob temperatura ambiente, por 60±5 min.  Misturar bem, procedendo-se a seguir à determinação do pH com o auxílio de uma tira de medição. Ajustar, se necessário, para o valor de 6,8 ± 0.2. Adicionar então 2,25 mL de Tergitol Aniônico 7 e misturar bem. Alternativamente pode-se utilizar Triton X-100.

 

    2.2) Fase de Pré-Enriquecimento das amostras

          Os sacos deverão ser transferidos para uma estufa bacteriológica e incubados por 24 ± 2 h at 35°C.

 

    2.3) Fase de Enriquecimento Seletivo das amostras

          Da mistura pré-enriquecida, deve-se transferir com o auxílio de uma pipeta automática, 0,1mL e 1mL para tubos contendo 10 mL do caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) e 10 mL de caldo Tetrathionato, respectivamente.. O caldo RV deverá ser incubado por 24 ± 2 h at 42 ± 0.2°C e o caldo TT por 24 ± 2 h at 43 ± 0.2°C, ambos em banho-maria.

 

    2.4) Fase de plaqueamento em meios seletivos

          A partir dos caldos de enriquecimento seletivo, realizar estrias em placas com ágar Sulfito de Bismuto (BS), ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) e ágar Hektoen (HE), sendo as mesmas a seguir incubadas em estufa bacteriológica por 24 ± 2 h at 35°C. As placas de BS deverão ser preparadas no dia anterior à sua utilização e serem mantidas no escuro, sob temperatura ambiente.

 

Morfologia típica de colônias de Salmonella:

Ágar BS: colônias marrons ou pretas com ou sem brilho metálico. O meio ao redor das colônias muda gradativamente para uma coloração marrom a preta, com o prolongamento do tempo de incubação.

Ágar XLD: colônias cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias com centro preto grande e brilhante, ou mesmo inteiramente pretas.

Ágar HE: colônias verde-azuladas, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias inteiramente pretas.

 

Obs: se colônias típicas estão presentes no ágar BS após 24 ± 2 h de incubação, toma-se então 2 ou mais delas para triagem bioquímica inicial em ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) e ágar Lisina Ferro LIA). Independentemente ou não da presença dessas colônias típicas, as placas devem ser reincubadas por um período adicional de 24 ± 2 h. Após 48 ± 2 h de incubação, somente volte a tomar 2 ou mais colônias típicas se aquelas transferidas inicialmente para os ágars TSI e LIA tiverem produzido reação atípica nos mesmos, permitindo o seu descarte como não-Salmonella. Ver posteriormente a descrição das reações típicas de Salmonella nos ágars TSI e LI.A.

 

Morfologia de colônias atípicas de Salmonella:

            Na ausência de colônias típicas ou suspeitas de Salmonella, procura-se por colônias atípicas, como as descritas a seguir:

Ágars HE e XLD: as salmonelas podem aparecer na forma de colônias amarelas, com ou sem centro negro Na ausência de colônias típicas após 24 ± 2 h de incubação, então tome 2 ou mais das atípicas para confirmação bioquímica posterior.

Agar BS: algumas cepas podem se apresentar na forma de colônias verdes com pouco ou nenhum escurecimento do meio adjacente. Na ausência de colônias típicas após 24 ± 2 h de incubação, reincube as placas por mais 24 ± 2 h adicionais. Se não houver colônias suspeitas após esse período, então tome duas ou mais colônias atípicas e transfira para tubos de TSI e LIA.

 

          Nessa fase de plaqueamento seletivo devem ser utilizadas cepas padrões de Salmonella  para evidenciamento de reações características e não características do patógeno nos três meios de cultura empregados.

- cepa controle com morfologia típica: Salmonella Typhimurium (ATCC 14028 ou de bacterioteca nacional)

- cepas controle com morfologia atípica: Salmonella diarizonae  (ATCC 12325 ou de bacterioteca nacional) – lac (+) e H2S (+), Salmonella abortus equi (ATCC 9842 ou de bacterioteca nacional) – lac (-) e  H2S (-)

 

    2.5) Confirmação preliminar das colônias de Salmonella

          É feita com as colônias típicas e atípicas de Salmonella isoladas nos ágars seletivos citados. A transferência das colônias é feita com o auxílio de uma agulha de inoculação. Remove-se uma porção da massa de células do centro da colônia desejada e realiza-se a transferência para os ágars TSI e LIA. A inoculação deve ser feita por picada e estrias na rampa, utilizando-se a mesma alçada para inocular ambos os tubos. Não é necessário nem recomendável flambar a agulha e retirar outra porção da colônia, entre um tubo e outro. Os tubos de TSI e LIA devem ser incubados por 35°C for 24 ± 2 h.

 

Reação típica de Salmonella em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Reação atípica em TSI, que não deve ser descartada se as demais reações em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H2S (Fig. 1).

 

Reação típica de Salmonella em LIA: fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração daa cor do meio), com ou sem a produção de H2S (escurecimento do meio). Reação atípica em LIA, que não deve ser descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S (Fig. 1) .

 

Observações:

1-     se as placas de HE, BS ou XLD apresentarem colônias típicas, porém não isoladas de Salmonella, deve-se estriar uma alçada da colônia, tomada no centro e, se possível, sem tocar nas colônias adjacentes, estriar em placas de HE ou XLD, para purificação da cultura. Somente então, a partir da colônia pura, deve-se inocular os tubos de TSI e LIA.

2-     os tubos de TSI devem ser inclinados com fundo de no mínimo 2,5 cm e incubados com a tampa ligeiramente afrouxada, para manter condições aeróbicas. Esse cuidado objetiva prevenir a excessiva produção de H2S e reações ácidas errôneas na rampa. Se, ainda assim, houver excessiva produção de H2S, mascarando a reação ácida  do fundo, deve-se assumir a reação como típica.

3-     os tubos de LIA devem ser inclinados com fundo de no mínimo 4,0 cm e incubados com tampa bem fechada, porque a reação de descarboxilação da lisina ocorre anaerobicamente. A exclusão do ar previne resultados falso positivos, resultantes da desaminação oxidativa das peptonas do meio de cultura.

 

 

Figura 1: tubos de TSI e LIA característicos

 

 

 

2.6) Testes sorológicos e bioquímicos para confirmação definitiva

     Serão realizados os seguintes testes a partir das colônias puras:

- teste sorológico somático polivalente

- teste de urease

- teste de fermentação de dulcitol

- teste de indol

- teste de malonato

 

     Serão consideradas como Salmonella todas as colônias que apresentarem as seguintes características:

 

- reações típicas em TSI e LIA

- teste sorológico somático polivalente (+)

- teste de urease (-)

- teste de fermentação do dulcitol (+)

- teste de indol (-)

- teste de malonato (-)

 

     Culturas com uma ou mais reações atípicas devem ser submetidas a testes adicionais, relacionados a seguir:

 

- teste de fermentação da lactose e sacarose

- teste de vermelho de metila e Voges-Proskauer

- teste de citrato

- teste de descarboxilação da lisina em caldo

- teste sorológico flagelar polivalente



1. ANDREWS, W.H,   HAMMACK, T.S. Salmonella. Bacteriological Analytical Manual.  Gaitherburg:U.S.A.  Food and Drug Administration, 1998. Disponível em: < http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html >. Acesso 15 jul. 2003